ELISA样本制备指南及注意事项

ELISA样本制备指南及注意事项

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定义及介绍

ELISA（enzyme linked immunosorbent assay，酶联免疫吸附测定）是最基础的免疫学实验之一，其理论基础是抗原抗体的特异性反应。ELISA因其特异性强、灵敏度高、稳定性好而被广泛使用。ELISA试剂盒检测样品包括血清、血浆、细胞培养上清、灌洗液或尿液等生物样本，实验操作步骤并不繁琐，但实验完成后需要把样本检测结果OD值转化为浓度值，从而供下一步分析所用，因此样品的预处理对于后续数据处理和结果分析非常重要。

样本制备指南

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血清

全血样品于室温放置2小时或2-8℃过夜后于2-8℃，1000×g离心20min，取上清即可检测。收集血液的试管应为一次性的无内毒素试管。避免使用溶血，高血脂样品

2.血浆

抗凝剂推荐使用EDTA-Na

，样品采集后30min内于2-8℃，1000×g离心15min，取上清即可检测。

3组织匀浆/组织全蛋白

用预冷的PBS (0.01M, pH=7.4)冲洗组织，去除残留血液，称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS(一般按1:9的重量体积比，比如1g的组织样品对应9mL的PBS，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录。推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂)加入玻璃匀浆器中，在冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行反复冻融或超声破碎。最后将匀浆液于2-8℃，5000×g离心5-10min，取上清检测。

其余方法：在分析天平（AL204型）上，称量50-100mg组织样本。在样本中加入5倍质量体积的含1%PMSF的1×PBS缓冲液；并用小剪刀等工具将组织样本剪碎（尽可能小块）。注：1×PBS缓冲液使用前，需加入PMSF，现用现加，PMSF终浓度为1mM。打开超声破碎仪，将超声破碎仪的功率调至25%，超声时间2s，间隔时间5s，总时间2min。放入样本，冰上超声3min。视样本匀浆情况调整总时长。超声完成后，将样本放于4℃或冰上裂解30min。打开离心机，将转速调至12000×g；将样本放入离心机，离心10min，取上清，按需要分装，于-20℃贮存。注：留取20μL样本，用于后续BCA法测定样本蛋白含量。

组织匀浆液或组织全蛋白中的蛋白浓度对于检测实验的影响至关重要，建议样本蛋白浓度至少1mg/mL以上，较低浓度蛋白的组织匀浆液有可能导致ELISA检测失败。

4.细胞提取液

贴壁细胞

用冷的PBS轻轻清洗，然后用胰蛋白酶消化，1000×g离心5min后收集细胞；

可直接离心收集。收集的细胞用冷的PBS洗涤3次。每10

个细胞中加入150-200μLPBS重悬(推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂；若含量很低可减少PBS的体积)并通过反复冻融或超声使细胞破碎。将提取液于2-8℃，1500×g离心10min，取上清检测。注：留取20μL样本，用于后续BCA测定。

其余方法：

对于

：去除培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍。以2百万细胞为例，在样本中加入100μL的含1%PMSF的1×PBS缓冲液，震荡混匀细胞，4℃或冰上裂解30min。用枪吹打数下，使裂解液和细胞充分接触。必要时可以进行超声处理，超声步骤与组织样本相同。

对于

：离心收集细胞，以2×10

细胞为例，在样本中加入100μL的含1%PMSF的1×PBS缓冲液，震荡混匀细胞，4℃或冰上裂解30min。用手指轻弹悬浮细胞以充分裂解。充分裂解后应没有明显的细胞沉淀。如果细胞量较多，必需分装成（5-10）×10

细胞/管，然后再裂解。必要时可以进行超声处理，超声步骤与组织样本相同。注：1×PBS缓冲液使用前，需加入PMSF，现用现加，PMSF终浓度为1mM。打开离心机，将转速调至12000×g；将样本放入离心机，离心10min，取上清，按需要分装，于-20℃贮存。注：留取20μL样本，用于后续BCA法测定样本蛋白含量。

5.细胞培养上清或其他生物体液

收集液体后于2-8℃，1000×g离心20min，除去杂质及细胞碎片。取上清检测。注：因细胞培养基中的胎牛血清影响或其他生物体液中杂蛋白的影响，不建议进行BCA法测定样本蛋白含量。

实验细节与注意事项

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收集血液应避免产生溶血现象。红细胞破碎，释放大量的过氧化物酶，会影响ELISA检测中的辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP）的酶促反应，造成检测结果的不确定性。

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样品收集后若在1周内进行检测可保存于2-8℃，若不能及时检测，请按一次使用量分装，冻存于-20℃(1个月内检测)，或-80℃(3个月内检测)，避免反复冻融。在检测前，冷冻过的样本应缓慢地融化并离心除去冻融过程产生的沉淀物。室温混匀后使用。

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试剂盒检测范围不等同于样本中待测物的浓度范围，建议实验前通过相关文献预估样本中待测物的浓度并通过预实验确定样本的实际浓度情况。如果样品中待测物浓度过高或过低，请对样本做适当的稀释或浓缩。

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检测样本的稀释推荐多步稀释法，常规稀释检测为血清/血浆检测稀释度为2倍、20倍、200倍；细胞上清稀释度为5倍、50倍、500倍；建议实验前通过相关文献预估样本中待测物的浓度。

对于稀释倍数比较大的检测样本，参考稀释方案如下：

稀释100倍：一步稀释。取5μL样本到495μL标准品/样本稀释液内，做100倍稀释；

稀释1000倍：两步稀释。取5μL样本到95μL标准品/样本稀释液内，做20倍稀释，再取5μL 20倍稀释样本到245μL标准品/样本稀释液内，做50倍稀释，总共稀释1000倍；

稀释100000倍：三步稀释。取5μL样本到195μL标准品/样本稀释液内，做40倍稀释，再取5μL 40倍稀释样本到245μL标准品/样本稀释液内，做50倍稀释，最后取5μL 2000倍稀释样本到245μL标准品/样本稀释液内，做50倍稀释，总共稀释100000倍；

每步稀释时取液量不少于3μL，稀释倍数不超过100倍。每步稀释都需混合均匀，避免起泡。

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若所检样本不在说明书所列样本之中，建议做预实验验证其检测有效性。

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若使用化学裂解液制备组织匀浆或细胞提取液，由于引入某些化学物质会导致ELISA测值出现偏差。

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某些重组蛋白可能与试剂盒中捕获或检测抗体不匹配而出现不能检测的情况。

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对于组织匀浆、组织全蛋白、细胞提取液等蛋白提取样本，经BCA法测定样本蛋白含量后，建议进行蛋白浓度的统一化，避免因组织重量、细胞数、产物体积等因素造成的人为误差；例如，统一全部检测样本浓度为1-2mg/mL，进行后续的稀释和检测。

券商中国5月19日财闻联播

08:41

来自券商中国

以上音频技术来自：讯飞配音

券商中国 罗晓霞/整理

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疫情最新动态>

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郑大女生私会男友，室友冒名顶替核酸，感染新冠被立案>

据中国小康网报道，郑州市二七区防疫指挥部发布消息，4人因违反防疫规定被立案调查。近日，郑州大学音乐学院一女生在学校封闭管理期间私自外出并与男友约会。外出期间二人观看电影、吃烧烤、打车返回学校。该名女生于5月5号被确诊感染新冠。经调查发现，这名女生5月3号的核酸检测结果为其室友冒名顶替。5月5日该名女生高烧39.8度，再次私自外出到医院发热门诊就诊，随即被确诊新冠阳性。对其展开流调后发现，确诊女生于5月4日公布的其他感染者（第29号感染者）存在行程交集。确诊病例被转移后，郑大连夜开启了核酸检测，郑大南校区实行封闭式管理，连夜转移1000人到焦作市隔离。郑大北区送到体育馆隔离。

据悉，该学子存在不执行防疫政策、擅自外出、进出饭店不扫码，故意隐瞒活动轨迹等问题，最终被确证为新冠肺炎，现被以涉嫌妨害传染病防治罪立案。5月6号晚间，郑州市二七区防疫指挥部发布消息，4人因违反防疫规定被立案调查。

国家卫健委：昨日新增本土确诊病例191例，新增本土无症状感染者825例>

5月18日0—24时，31个省（自治区、直辖市）和新疆生产建设兵团报告新增确诊病例212例。其中境外输入病例21例；本土病例191例（上海82例，北京50例，四川34例，河南11例，天津7例，吉林6例，广东1例），含57例由无症状感染者转为确诊病例（上海48例，天津4例，北京2例，吉林2例，四川1例）。新增死亡病例1例，为本土病例，在上海；无新增疑似病例。新增无症状感染者870例，其中境外输入45例，本土825例（上海637例，四川115例，天津26例，吉林15例，安徽12例，河南9例，北京5例，辽宁3例，江苏2例，广东1例）。

上海：下一步将分两阶段鼓励支持企业恢复运营>

今天（5月19日）上午举行的市疫情防控工作新闻发布会上，上海市副市长张为介绍企业复工复产有关情况。下一步，我们将继续坚持统筹疫情防控和经济社会发展，每个阶段企业达到相应防疫要求并经确认后可复工复产。主要分为两个阶段：第一阶段，为至5月底之前，企业主要采取闭环或半闭环运行；第二阶段（6月上旬开始），根据全市疫情防控形势，加快复工复产向纵深推进，持续扩大企业复工面，开放无疫情风险区域内企业与小区间的正常通行。

上海：拟从5月22日起，逐步恢复跨区公共交通>

据今天（5月19日）上午举行的市疫情防控工作新闻发布会介绍，上海将分步、稳妥地推进城市公共交通系统的恢复。共分为“三步走”：

第一步，近期我们已开始在远郊区开展公共交通压力测试。金山、奉贤、崇明等区逐步恢复区内公交线路，巡游出租车也正在逐步开放通行。

第二步，随着全市各区疫情形势的平稳，拟从本月22日起逐步恢复跨区公共交通。

第三步，直到疫情形势彻底平稳，市内公共交通将全网恢复基本运行，对外交通也将基本恢复。

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宏观动态>

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银保监会拟统一银行保险机构消费者权益保护监管标准>

中国银保监会起草了《银行保险机构消费者权益保护管理办法（征求意见稿）》，现向社会公开征求意见。其中提到，从规范产品设计、营销宣传、销售行为，禁止误导销售、捆绑搭售、不合理收费等方面作出规定，保护消费者知情权、自主选择权和公平交易权；从保护消费者金融资产安全、规范保险公司核保和理赔活动等方面作出规定，保护消费者财产安全权和依法求偿权；从收集、使用、传输消费者个人信息等方面作出规定，保护消费者信息安全权。

多地拟将试管婴儿费用纳入医保，浙江提高0-6岁婴幼儿医保报销比例>

据一财报道，自三孩政策实施以来，多地密集发布生育支持政策。其中医保对生育的支持是一个重要内容。根据近期发布的《浙江省医疗保障局关于支持“浙有善育”促进优生优育工作的通知（征求意见稿）》提出，提高0-6岁婴幼儿医保报销比例。0—6岁婴幼儿基本医保报销比例较普通城乡居民提高10个百分点左右。近年来，不孕不育人群日益增多，将包括试管婴儿在内的辅助生殖技术纳入医保报销的呼声很大。此次浙江发布的通知提出，要制定人工授精和试管婴儿等治疗不孕不育的辅助生殖相关技术医疗服务价格，按照国家相关规定，适时将其纳入生育保险支付范围。

安徽阜阳：首套房首付比例降至20%，鼓励房企减免3%-5%房款>

安徽省阜阳市房屋管理局出台《关于有效应对疫情促进房地产市场良性循环和健康发展的通知》，其中提到，降低借款人资金成本，首套房首付比例最低降至20%；引导房地产开发企业在自愿的基础上，为购买新建商品住房的个人或家庭，提供总房款减免3%-5%的优惠。

江苏常州大幅调低二套房首付比例：由60%降为30%>

今日，常州市市场利率定价自律机制发布关于调整常州市商业性个人住房贷款最低首付比例的通知，自2022年5月19日起，对常州市区范围内，已拥有一套住房且相应贷款未结清的居民家庭，再次申请商业性个人住房贷款时，最低首付比例调整为不低于30%。

四川泸州：部分人员购买首套或二套新建商品住房，按购房款2%补助>

四川省泸州市住房和城乡建设局等五部门联合印发《促进房地产市场平稳健康发展的若干措施（试行）》，对现役军人、退役军人、泸州市农村户籍人员、非泸州市户籍人员、毕业未满五年的大学（包括专科和本科）毕业生，以及按国家生育政策已生育二孩、三孩的家庭，在中心城区建设用地范围内购买首套或二套新建商品住房的，按购房款总额的2%给予一次性购房补助。

福建漳州：公积金可用于支付购房首付>

福建省漳州市住建局发布通知，公积金可直接用于支付购房首付。购房职工（含共有产权人）及配偶在漳州市所辖区域内，购买新建商品住房（含共有产权房、限价房以及其他配售型保障性住房），可向市住房公积金中心申请提取公积金账户内住房公积金（含住房补贴），用于支付购房首付款。额度方面，提取总额不得超过《商品房买卖合同》约定首付款。

特斯拉CEO马斯克：不再支持民主党，将改投共和党>

特斯拉CEO马斯克发布推特表示：“我过去曾投票给民主党，因为他们（大部分）是好心的政党。但他们已变成分裂及仇恨的政党，因此我再也无法支持他们，将投给共和党。现在，看着他们针对我的肮脏手段展开吧。”他还在另一则推文中写到：“未来几个月针对我的政治攻击将急剧升级。”

乌克兰农业政策与粮食部长：今年乌粮食产量可能下降50%>

乌克兰农业政策与粮食部长索利斯基当地时间5月18日在以视频方式参加一场国际会议时表示，今年乌克兰的粮食产量有可能下降50%，越冬作物的播种也将受到严重影响。国际社会应该做好每吨小麦的价格由目前的430美元涨至700美元的准备。

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金融机构>

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19家私募年内自购金额合计超27亿，百亿私募成主力军>

私募排排网统计显示，截至今日，今年以来已有19家私募宣布自购，自购金额达27.65亿元，百亿私募就有15家，合计自购金额26.38亿元，成为自购阵营的主力军，其中宁泉资产、石锋资产、凯丰投资、九坤投资、景林资产、汉和资本、永安国富、幻方量化、灵均投资的自购金额均超过1亿元。

美国最高反垄断执法机构承诺打击私募基金交易>

据英国金融时报，美国最高反垄断执法机构警告称，司法部将对私募股权投资公司在美国经济领域的扩张采取更强硬立场，目标是那些基本上避开了监管机构审查的收购集团。美国司法部反垄断部门负责人Kanter称：“有时，（私募股权公司的动机）旨在掏空或卷走一个行业，本质上是套现。”Kanter决定以该行业为目标，因为黑石、KKR和阿波罗等收购公司已成长为多元化企业集团，控制着美国经济的大部分领域，从零售连锁店到医院和数据中心。私募股权公司去年宣布了创纪录的14730笔交易，价值12万亿美元，几乎较2007年高点翻倍。

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市场数据>

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两市融资余额增加14.36亿元>

截至5月18日，上交所融资余额报7768.48亿元，较前一交易日增加16.41亿元；深交所融资余额报6695.79亿元，较前一交易日减少2.05亿元；两市合计14464.27亿元，较前一交易日增加14.36亿元。

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公司动态>

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“i茅台”客服：部分酒品设置了申购距离>

“i茅台”正式上线，100ml“迷你版”飞天茅台等多种酒品上架。不过，多地消费者表示买不到。“i茅台”客服向中证报记者表示，受疫情影响，各地区情况都不一样，在实时变化。至于为何同一地址有些品类能买有些买不了，客服表示，为了客户就近到店自提，系统对部分产品做出了距离限制，超出距离就申购不了，具体以APP为准。

美的回应裁员传闻：鉴于对内外部环境的判断，有序收缩非核心业务>

据财联社报道，从脉脉平台获悉，美的集团官方号回应近期裁员传闻。公司称：“今年，鉴于对内外部环境的判断，公司有序收缩非核心业务，暂缓非经营性投资，多措并举，进一步夯实增长潜力，提高经营业绩。”

特斯拉Autopilot在致命车祸中的作用遭到安全监管机构调查>

据华尔街日报报道，美国汽车安全监管机构已对涉及特斯拉车辆的致命车祸展开特别调查，这起事故已造成三人死亡。美国全国高速公路交通安全委员会周三披露了这一调查，确认事故车辆为2022年产的特斯拉Model S。该机构将这起事故添加到其正在调查的可能与半自动驾驶功能有关的汽车事故清单中。该监管机构已经披露，正在调查30多起疑似使用自动驾驶功能Autopilot的特斯拉汽车卷入严重车祸的事件。NHTSA的记录显示，清单上的其他一些特斯拉汽车碰撞事故也导致了人员死亡。

面板双雄群创、友达否认合并传言>

据台湾经济日报，鸿海集团将撤出群创董事会，友达集团前董事长李焜耀不再参选董事，市场传出是为面板双雄合并埋下伏笔，借由合并后的新公司，取得全球大尺寸面板市占优势，紧追龙头京东方。群创、友达18日均否认合并传言。

责编：桂衍民